血液/血清/血浆/精浆/上清液/FFPE 样本/组织样本 送样参考

血液样本中的DNA/RNA可来源于白细胞、红细胞(哺乳动物成熟红细胞没有细胞核，不含DNA or RNA)、血小板(血小板没有细胞核，但是可能有极少量RNA)，以及血清中游离的DNA/RNA.

样品量：动物血液$\geq$2ml; 动物血液(红细胞有核类)$\geq$1ml。 处理方法：

  1）离心分离得到白细胞或者有核细胞，加trizol处理，液氮速冻干冰运输；
  2）PAXgene RNA tube法；
  3）trizol法
  备注：人血液样本推荐使用PAXgene法，操作更为简单，提取的RNA质量也更高。

a) trizol法样品的制备：

  1）取15ml管1个，加入6ml trizol和2ml新鲜血液（比例3:1），用移液枪吹打几次帮助细胞裂解。
  2）样品剧烈震荡混匀1-2min，直到絮状物全部溶解。
  3）室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。
  4）写好编号，封口膜封存，-80°C冻存。
  5）干冰保存寄送。
  备注：冰冻血液的溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶，引起RNA降解，因此建议老师按照流程要求在冰冻前分装好样品，避免冰冻样品再次溶解分装造成的RNA降解。trizol法提取经验，人血液RNA得率约2.5ug/ml全血，有轻微降解。

b) BD PAXgene Blood RNA tube采血管及提取方法（提取总RNA，适用于人和灵长类动物）:

  采集血样（采血管客户自备）
  产品名称：BD 762165 PAXgene Blood RNA Tube；（QIAGEN）
  中文名称：BD静脉真空采血管（全血RNA管）；
  参考价格：158¥/管；
  容量：2.5ml；

供参考

  常规trizol法提取RNA。
  若用BD管采集的血液需要使用QIAGEN专用试剂盒进行RNA提取。
  试剂盒名称：PAXgene Blood miRNA Kit（QIAGEN 50次）
  货号：763134，参考价格：5000¥/盒，具体操作流程参见说明书。

现今研究表明，血液中的游离核酸与肿瘤、妊娠相关疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤急救医学等有着密切联系。动物细胞会主动分泌直径约40～100nm的囊泡，其中会携带DNA、RNA（以片段的RNA为主，会有部分mRNA/lncRNA/circRNA）、蛋白质等，这种脂质囊泡被称为外泌体。已有研究表明外泌体参与到免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结等主要的生物学工程。

血液/血浆/细胞上清液样本制备:

  送样量 血清/血浆>4ml, 细胞培养上清液>10ml。

a) 血清样本制备（不加抗凝剂）:

  1）采血后，轻轻将全血滴入洁净的EP管或离心管；
  2）4°C下静置3～4小时，可见血块析出（也可放置4度冰箱过夜）；
  3）5000rpm，4°C离心10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再3000rpm，4°C离心10min，以最大程度保证血清质量；
  4）将血清分装，可冻存于-80°C；
  5）干冰运输

b) 血浆样本制备:

  1）用采血针和抗凝管（含EDTA或者柠檬酸钠）抽取全血，混匀；
  2）4°C静置3～4h（也可放置4°C冰箱过夜），5000rpm，4°C离心5min，取上清即为血浆；
  3）可将血浆分装，冻存于-80°C；
  4）干冰运输；
  

c) 血清/血浆/细胞培养上清液样本RNA提取方法:

  样本建库要求：SmallRNA建库需要总量total RNA>10ng,浓度2ng/ul;lncRNA建库需要total RNA>20ng,浓度2ng/ul,采用微量建库方法。
  可选的提取方法：trizol法。
  sigma公司的GenElute Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit.货号：RNB500-50RXN QIAGEN的miRNeasy Serum/Plasma Kit(50次)，用于从动物及人体血浆和血清中纯化包括miRNA的无细胞总RNA.

绝大部分精浆游离mRNA（cell-free seminal mRNA，cfs-mRNA）存在于精浆微囊泡中，从而保护不被精浆RNA酶降解。由于精浆小体直径大部分在0.10um以上，RNA提取时可采用0.10um滤膜对精浆标本微过滤截留大部分精浆小体，用于提取cfs-mRNA，检测这种基于存在形式的提取方法的提取量，同时也是对cfs-mRNA的存在形式进行证实性研究。精浆样本可用于small RNA测序，lnc RNA测序等。

a) 精浆样本送样建议

  对于精浆样本一般要求精浆样本或者客户提取好的total RNA。保存建议使用低温条件收集好的精浆，-80°C保存。

b) 精浆样本RNA提取方法

• 样本建库要求：Small RNA建库需要样本总量total RNA>10mg,浓度2ng/ul;lncRNA建库需要total RNA>20ng,浓度2ng/ul,采用微量建库方法。
• RNA提取要求：如果样本为富集好的精浆微囊泡可直接采用trizol法提取RNA。若直接从精浆中提取全RNA可选择使用PEG去除多糖后使用trizol法提取RNA。

提取方法供参考：

  1）0.2ml精浆与0.25ml TRI reagent buffer(0.15NaCl, 1% SDS, 2.5mM EDTA, 0.1M Tris-Hcl, pH=8.0)混合，加入9mg PEG 20000 (Sigma) 调至终浓度2%(W/V) 
  2）在室温中孵育10min，4°C, 13000rpm离心10min取上清。用于trizol法提取RNA。

福尔马林固定后石蜡包埋的组织称为FFPE样品，可用于转录组测序，构建去核糖体的链特异性文库。

FFPE送样建议:

  1）获得样品后，尽快开始固定
  2）将样本切薄再浸泡（如果能到5mm或更薄最好）
  3）避免过度固定，浸泡时间过长
  4）纯化的样品最好是固定或者包埋时间在半年内的样本。放置时间越长，对于RNA纯化越不利。

送样量建议:

  组织>10个切片或卷片，RNA提取后40%以上在200bp以上，total RNA大于5ug，RIN值2-3；样本常温或者冰袋寄送即可。
  

FFPE样本RNA提取方法:

  可选用QIAGEN的RNeasy FFPE Kit（50）试剂盒，可从FFPE组织切片中纯化总RNA。货号ID：73504

$\color{red}{特别提示}$：为确保实验的顺利，建议样品备份1-2份，以防备部分样品降解重新取材、制备或送样，耽误时间。

• 1) 优先选用新鲜采集的样品送样。采集样品时应选取核酸含量较多的部位；
• 2) 采集时建议活体取材后用RNase free water进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，将样品分割成$\color{red}{50～100mg}$左右的小块(组织块越小，保存效果越好)，样品分割和处理时应尽量在冰上进行，防止样品中的内源酶开始降解RNA。液氮速冻之后放入预冷处理螺纹的EP管中，-80°C保存，干冰寄送；
• 3) 抑制内源酶活性的方法
  • A.立即加入裂解液，并彻底而迅速匀浆
  • B.切成小块后立即投入液氮冷冻
  • 这两个办法都要求操作快速。前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织;后者适合所有的样品，通常，肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、脑、脂肪、肌肉组织等选择后者；
• 4) 对肿瘤组织的取材，为了保证结果的准确可靠，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判断要进行研究的取材部位，取样后 液氮速冻，干冰运输；
• 5) 肿瘤组织本身RNase较活跃，离体后请立即速冻、分割组织，约$\color{red}{2～3mm}$厚，放入预装有$\color{red}{\mathrm {RNAlater(RNA组织保存试剂)}}$的1.5ml或2.0ml RNase-free EP 管中，液氮速冻后 用封口膜封口，干冰运输;
• 6) 样品采集时建议将样品按照一次提取的量进行分管保存，避免提取时由于二次分管和并管引起样品降解;
• 7) 锡箔纸包装的组织样品，折叠时需有纹理可循，避免打开锡箔纸时样品洒落;
• 8) 每份样本请尽量多管分装(50mg左右per tube)，并同时寄送备用样品和试提样品;

$\color{red}{特别提示}$：为确保实验的顺利，建议样品备份1-2份，以防备部分样品降解重新取材、制备或送样，耽误时间。

• 1) 请将制备好的 RNA 样品保存在 RNase free water 中，并只能置于1.5ml或2.0ml的不黏管(如 Eppendorf LoBind Tube、Ambion Non-stick Tube 等)内，并用封口膜封好。对于未按要求溶解的样品，如采用乙醇、醋酸钠等溶解，质检报告将推迟为 7-10个工作日内完成，样品的处理需要另外收费；
• 2) 核酸样品建议使用1.5ml、2ml EP管装载样品，其他保存管容易破裂且不利于保存样品和后续实验的开展；
• 3) 为了防止样品污染和混乱，禁止使用96孔板和深孔板装载样品；
• 4) 为了防止样品运输途中由于干冰挤压而损坏，少于10管的样品建议将EP管放入50ml离心管，并在50ml离心管中用棉花或卫生纸固定;大量样品建议将EP管放在冻存盒中，并在冻存盒外面包裹气泡垫；
• 5) 用乙醇沉淀的样品运输中会有少量乙醇挥发出，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。