血液/血清/血浆/精浆/上清液/FFPE 样本/组织样本 送样参考
样本 | 样本制备 | 适用范围 | 建议送样量 | 文库构建核酸量 | 备注 |
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血液 | 1、三倍trizol震荡混匀冻存 | 转录组, lncRNA, smallRNA | 普通转录组$\geq$2ml, circRNA$\geq$5ml | $\geq$1ug(正常建库), $\geq$200ng(低起始量建库) | $\color{red}{切勿全血直接冻存!}$ |
血浆/细胞上清液 | 直接冻存 | lncRNA测序, smallRNA测序 | 血浆/血清$\geq$4ml, 细胞上清液$\geq$10ml | sRNA文库:total RNA$\geq$10ng, 浓度2ng/ul; lncRNA文库:total RNA$\geq$20ng, 浓度2ng/ul | |
精浆 | 直接冻存 | lncRNA测序, smallRNA测序 | 建议客户自提RNA | sRNA文库:total RNA$\geq$10ng, 浓度2ng/ul; lncRNA文库:total RNA$\geq$20ng, 浓度2ng/ul | 如果直接用精浆提取RNA建议添加多糖 |
FFPE样本 | 1、样本尽快开始固定; 2、样本切薄再浸泡(<5mm); 3、避免过度固定; 4、半年内的样本 | 转录组测序 | 组织>10个切片或卷片 | $\geq$5ug | 常温或冰袋寄送即可 |
组织样品 | 立即速冻 | 转录组/lncRNA/smallRNA | 普通转录组组织干重$\geq$300mg;sRNA/lncRNA$\geq$500mg;circRNA$\geq$1g | m$\geq$2.5ug(单次建库),浓度$\geq$100ng/μl |
血液样本中的DNA/RNA可来源于白细胞、红细胞(哺乳动物成熟红细胞没有细胞核,不含DNA or RNA)、血小板(血小板没有细胞核,但是可能有极少量RNA),以及血清中游离的DNA/RNA.
样品量:动物血液$\geq$2ml; 动物血液(红细胞有核类)$\geq$1ml。 处理方法:
1)离心分离得到白细胞或者有核细胞,加trizol处理,液氮速冻干冰运输; 2)PAXgene RNA tube法; 3)trizol法 备注:人血液样本推荐使用PAXgene法,操作更为简单,提取的RNA质量也更高。
a) trizol法样品的制备:
1)取15ml管1个,加入6ml trizol和2ml新鲜血液(比例3:1),用移液枪吹打几次帮助细胞裂解。 2)样品剧烈震荡混匀1-2min,直到絮状物全部溶解。 3)室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。 4)写好编号,封口膜封存,-80°C冻存。 5)干冰保存寄送。 备注:冰冻血液的溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶,引起RNA降解,因此建议老师按照流程要求在冰冻前分装好样品,避免冰冻样品再次溶解分装造成的RNA降解。trizol法提取经验,人血液RNA得率约2.5ug/ml全血,有轻微降解。
b) BD PAXgene Blood RNA tube采血管及提取方法(提取总RNA,适用于人和灵长类动物):
采集血样(采血管客户自备) 产品名称:BD 762165 PAXgene Blood RNA Tube;(QIAGEN) 中文名称:BD静脉真空采血管(全血RNA管); 参考价格:158¥/管; 容量:2.5ml;
供参考
常规trizol法提取RNA。 若用BD管采集的血液需要使用QIAGEN专用试剂盒进行RNA提取。 试剂盒名称:PAXgene Blood miRNA Kit(QIAGEN 50次) 货号:763134,参考价格:5000¥/盒,具体操作流程参见说明书。
现今研究表明,血液中的游离核酸与肿瘤、妊娠相关疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤急救医学等有着密切联系。动物细胞会主动分泌直径约40~100nm的囊泡,其中会携带DNA、RNA(以片段的RNA为主,会有部分mRNA/lncRNA/circRNA)、蛋白质等,这种脂质囊泡被称为外泌体。已有研究表明外泌体参与到免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结等主要的生物学工程。
血液/血浆/细胞上清液样本制备:
送样量 血清/血浆>4ml, 细胞培养上清液>10ml。
a) 血清样本制备(不加抗凝剂):
1)采血后,轻轻将全血滴入洁净的EP管或离心管; 2)4°C下静置3~4小时,可见血块析出(也可放置4度冰箱过夜); 3)5000rpm,4°C离心10min,可见淡黄色血清,取出上清后可再3000rpm,4°C离心10min,以最大程度保证血清质量; 4)将血清分装,可冻存于-80°C; 5)干冰运输
b) 血浆样本制备:
1)用采血针和抗凝管(含EDTA或者柠檬酸钠)抽取全血,混匀; 2)4°C静置3~4h(也可放置4°C冰箱过夜),5000rpm,4°C离心5min,取上清即为血浆; 3)可将血浆分装,冻存于-80°C; 4)干冰运输;
c) 血清/血浆/细胞培养上清液样本RNA提取方法:
样本建库要求:SmallRNA建库需要总量total RNA>10ng,浓度2ng/ul;lncRNA建库需要total RNA>20ng,浓度2ng/ul,采用微量建库方法。 可选的提取方法:trizol法。 sigma公司的GenElute Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit.货号:RNB500-50RXN QIAGEN的miRNeasy Serum/Plasma Kit(50次),用于从动物及人体血浆和血清中纯化包括miRNA的无细胞总RNA.
绝大部分精浆游离mRNA(cell-free seminal mRNA,cfs-mRNA)存在于精浆微囊泡中,从而保护不被精浆RNA酶降解。由于精浆小体直径大部分在0.10um以上,RNA提取时可采用0.10um滤膜对精浆标本微过滤截留大部分精浆小体,用于提取cfs-mRNA,检测这种基于存在形式的提取方法的提取量,同时也是对cfs-mRNA的存在形式进行证实性研究。精浆样本可用于small RNA测序,lnc RNA测序等。
a) 精浆样本送样建议
对于精浆样本一般要求精浆样本或者客户提取好的total RNA。保存建议使用低温条件收集好的精浆,-80°C保存。
b) 精浆样本RNA提取方法
提取方法供参考:
1)0.2ml精浆与0.25ml TRI reagent buffer(0.15NaCl, 1% SDS, 2.5mM EDTA, 0.1M Tris-Hcl, pH=8.0)混合,加入9mg PEG 20000 (Sigma) 调至终浓度2%(W/V) 2)在室温中孵育10min,4°C, 13000rpm离心10min取上清。用于trizol法提取RNA。
福尔马林固定后石蜡包埋的组织称为FFPE样品,可用于转录组测序,构建去核糖体的链特异性文库。
FFPE送样建议:
1)获得样品后,尽快开始固定 2)将样本切薄再浸泡(如果能到5mm或更薄最好) 3)避免过度固定,浸泡时间过长 4)纯化的样品最好是固定或者包埋时间在半年内的样本。放置时间越长,对于RNA纯化越不利。
送样量建议:
组织>10个切片或卷片,RNA提取后40%以上在200bp以上,total RNA大于5ug,RIN值2-3;样本常温或者冰袋寄送即可。
FFPE样本RNA提取方法:
可选用QIAGEN的RNeasy FFPE Kit(50)试剂盒,可从FFPE组织切片中纯化总RNA。货号ID:73504
$\color{red}{特别提示}$:为确保实验的顺利,建议样品备份1-2份,以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间。
$\color{red}{特别提示}$:为确保实验的顺利,建议样品备份1-2份,以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间。